hla-dq β遗传多态与重症肌无力的易患性
中华神经科杂志 1998年第6期第31卷 论著
作者：张克雄 李霞 左伋 杜可明 朱定良 庚镇城 涂来慧 陈秀珍
单位：200032上海医科大学生物学教研室医学遗传研究室(张克雄、左伋、杜可明、陈秀珍);复旦大学遗传学研究所(李霞、朱定良、庚镇城）;上海第二军医大学长海医院神经科(涂来慧）
关键词： 重症肌无力；遗传易患性；胸腺瘤
【摘要】 目的 探讨hla-dqβ对重症肌无力（mg）的遗传易患性。方法 采用聚合酶链反应-限制片段长度多态性(pcr-rflp)法对35例mg患者及50名健康对照hla-dq β链对应的hla-dqb1基因进行分型,并对患者组和健康对照组的dqb1各等位基因频率和dq β氨基酸序列进行比较分析。结果 dqb1*0201和dqb1*0302的频率在患者组中升高,其中两组的dqb1*0302的频率差异具有显著性意义(rr=4.41,p＜0.05);hla-dq β氨基端57位的丙氨酸在患者组中显著升高(rr=5.10,p＜0.005),在伴有胸腺瘤的mg患者中差异更显著(rr=57.88,p＜0.001)。结论 hla-dqβ 57位的丙氨酸表现对中国人mg的易患性，特别是在伴有胸腺瘤的mg患者。这种易患性的遗传基础为非极性的疏水氨基酸丙氨酸替换了带负电荷的极性氨基酸天冬氨酸。
the polymorphism of hla-dq β chain and genetic susceptibility to myasthenia gravis in chinese zhang kexiong*，li xia, zuo ji, et al. *department of biology, shanghai medical university， shanghai 200032
【abstract】 objective to investigate the hla-dqβ genetic susceptibility to myasthenia gravis(mg) in chinese. methods polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (pcr-rflp) was used to determine the hla-dqb1 genotype of 35 mg patients and 50 healthy controls. subsequently the frequency of hla-dqb1 alleles and the amino acid sequences of the hla-dq β polymorphic aminoteriminal domain were compared between the mg patients and the healthy controls. results the frequency of dqb1 *0302 was significantly increased in the mg patients (rr=4.41, p＜0.05) compared to the controls when dqb1*0302 and dqb1*0201 all had a higher frequency in patients. it had been shown that the alanine in position 57 (ala57) of hla-dq β polymorphic aminoteriminal domain is positively correlated to mg (rr=5.1， p＜0.005) and a stronger association was observed in the mg patients with thymomas (rr=57.88, p＜0.001).conclusions hla-dqβ gene expressing ala57 contributes to the susceptibility to mg in chinese, especially in mg with thymoma. the substitution of neutral ala by negatively charged asp in position 57 of the hla-dq β chain is the genetic susceptible basis of mg.
【key words】 myasthenia gravis genetic susceptibility thymoma
人类白细胞抗原(hla)ii类分子是由α链和 β链构成的主要表达于b淋巴细胞、巨噬细胞及其他抗原提呈细胞表面的异源二聚体，其作用主要是将外来抗原多肽呈递给t辅助细胞以引起免疫应答。hla存在遗传多态现象，并表现出种族差异及与某些疾病发生的关联性。近年来，逐渐认识到hlaⅱ类中的dq分子在自身免疫病的发生中起非常关键的作用［1］。重症肌无力(mg)主要由神经肌肉接头处针对乙酰胆碱受体的自身抗体而引起，在白人的mg患者中已发现hla-dqb1*0201为其易患等位基因［2，3］，在日本人中发现dqβ参与mg的遗传易患机制［4，5］。在mg的小鼠模型中曾发现i-aβ链（相当于人类hla－dq β)的突变或介入针对i-a β链的单克隆抗体均可阻止mg的发生［6，7］。为进一步了解中国人mg的易患机制,我们研究了hla－dqb1遗传多态分型。
资料和方法
资料和方法
1.临床资料：35例mg患者由上海长海医院神经科诊断，胸腺组织病理根据ct检查并结合术后病理确定。35例中男性12例，女性23例；眼肌型5例，全身型30例。胸腺病理：胸腺增生10例，胸腺瘤7例。有些mg患者胸腺检查及年龄资料缺损，分临床亚型统计时不计在内。所有患者均为汉族，籍贯分布于江浙沪地区，年龄1～69岁，15～55岁占90%。
健康对照:共50名,籍贯同患者组，均为汉族，身体健康，无自身免疫疾病、神经肌肉疾病的病史或家族史。
2.基因组dna抽提:获取患者及健康对照外周血5 ml后按miller法［8］提取。
3.hla－dqb1的pcr－rflp分型按inoko研究组的方法［9］进行。
4.数据分析:相对危险率(rr)用woolf法计算,并用haldane式修正，在比较患者组与健康对照组等位基因频率差异性时，用halbau软件包(inoko赠送)直接计算出fisher确切p值，再乘以所比较的等位基因数后得最后的修正p值；用epi info软件对mg患者不同亚型与健康对照进行比较;并将患者分成两组比较，χ2用yates式校正并直接求出p值，适当时用fisher法算出确切p值。
结果
在所有mg患者和健康对照中共检出11种等位基因(附表)，其中hla-dqb1*0302在疾病组和健康对照组中所占比例分别为40%和12%，两组差异有显著意义(rr=4.41,p＜0.05)。hla-dqb1*0201在疾病组中比例为26%，健康对照则为8%,但差异无显著性意义。疾病组中未发现显著降低的等位基因。
将所有mg患者按性别、年龄、临床分型对各等位基因进行统计，未发现有意义的结果（资料未显示）。
对hla－dq β氨基酸的多态进行比较，发现了很有意义的结果。dqb1*0302和dqb1*0201编码的 β链57位为丙氨酸(ala)，35例mg患者中共20例表达ala，而50名健康对照中仅有10名表达ala,差异具有极显著性意义(rr=5.10,p＜0.005)。表现缬氨酸(val)的为dqb1*0402和0604，只有对照组中5例表现val。表现丝氨酸(ser)的为dqb1*0502,在所有35例mg患者中有1例表达ser,在健康对照中无一名表现为ser。除dqb1*0302、0201、0402、0604、0501之外，其他等位基因都表达为天冬氨酸(asp)。从患者和健康对照合起来看，中国人中hla－dqb β 57位点主要为ala或asp，占［(35＋50)－6］/(35＋50)，即93%。这与白人的结果明显不同［3］。
对hla－dq β 57位的所有4种氨基酸（ala、val、ser、asp)，将疾病组与健康对照进行比较，在ala57位点亦存在很有意义的结果。所有7例伴胸腺瘤的mg患者全部表达ala，而健康对照组中表达ala的个体占20%，两组差异有极显著意义(rr=57.88,p＜0.001)。发病年龄小于或等于30岁的mg患者表达ala的频率与健康对照比较时，rr=5.57，p＜0.05，而发病年龄大于30岁的患者与健康对照比较，差异无显著意义。在57位的val、ser和asp，未发现有意义的结果。
将患者按胸腺病理分成两组（胸腺瘤与非胸腺瘤组），对这两组mg患者的ala57进行比较，所有7例胸腺瘤mg患者表现阳性，所有19例非胸腺瘤mg患者中有7例表现为阳性,两组间差异具显著性意义，比数比(or)=12.00, p＜0.01；同样，将年龄分成两组分析时，差异亦无显著性意义。
讨论
结果显示,与健康对照相比，mg患者的dqb1*0302和dqb1*0201等位基因的频率明显升高，其中dqb1*0302与健康对照组差异有显著性意义。而这2种等位基因对应的57位氨基酸均为ala，详细分析表明,dq β 57位主要为ala或asp,共占93%，而在所有mg患者中，表现ala的个体频率比健康对照高，差异有极显著性意义（rr=5.10,p＜0.005)，特别是胸腺瘤组中表现得更为明显，即hla－dq β 57位的ala对mg易患。hlaⅱ类分子空间构象研究表明，其折叠成槽沟状以提呈抗原多肽，β链57位保守的asp可与α链76位保守的精氨酸(arg)形成盐桥，位于所呈递的外来抗原底部，β57
附表 mg患者组和健康对照组中hla-dqb1各等位基因表型频率的分布
组别 例数 等位基因表型数 等位基因表型频率(%) 02
01 03
01 03
02 03
03 04
01 04
02 05
01 05
02 06
01 06
02 06
04 02
01 03
01 03
02 03
03 04
01 04
02 05
01 05
02 06
01 06
02 06
04 对照组 50 4 3 6 4 2 4 0 1 42 31 1 8 6 12 8 4 8 0 2 84 62 2 mg组 35 9 3 14 1 3 0 1 1 26 12 0 26 9 40* 3 9 0 3 3 74 34 0
*与对照组相比，rr=4.41，p＜0.05；mg为重症肌无力
位氨基酸改变可影响其结构及稳定性［10］。asp是带负电荷的极性氨基酸，将hla－dq β 57位asp替换为ala时，ala为非极性氨基酸，表现疏水性，这样可能影响了盐桥结构，构成了hla－dq β 57位ala对mg易患性的基础。
结果中，早发型mg患者（发病年龄≤30岁）表现出比所有mg患者对ala57位的更高的相对危险率，但迟发型患者与正常对照相比,差异无显著意义。而2个年龄组间比较，未发现对ala57易患的显著差异，暗示早发型与迟发型无遗传易患的异质性，携带ala57只会使mg患者比较容易或较早发病，这同样支持上述ala57参与mg遗传易患的观点。
白人mg患者hla－dq β 57位的氨基酸分析也显示ala对早发型（≤30岁）的易患性，57位的val则对胸腺瘤型mg表现易患性［2］。val与ala一样均为中性的非极性氨基酸，这可用白人群体中val57有较高的频率来解释，此次中国人检出的hla－dqβ1*0302易患基因与白人中检出的hla－dqβ1*0201易患基因的57位氨基酸均为ala［2，3］。可以说，我们的结果与其有很大的相似之处，可见，hla－dq β 57位氨基酸对mg的易患性可能为超越种族范围的共同机制。
胸腺异常如胸腺增生或胸腺瘤常见于mg患者中，对achr自身抗体的产生也是t细胞依赖的，而t细胞又是在胸腺中发育成熟的，表明了胸腺在mg发生中的重要作用。所有7例伴胸腺瘤mg患者hla－dq β 57位均表现为ala，与健康对照比较，表现出极显著差异，而胸腺增生及胸腺正常者则无此显著差异，胸腺瘤组与非胸腺瘤组在ala57的易患性方面也表现显著不同，而早发与迟发型组之间未发现显著差异，提示胸腺瘤组与非胸腺瘤组可能具有不同的遗传易患基础。国外研究也有类似报道［11］。
hla－dq β 57的ala参与mg的遗传易患性，但并不是所有的mg患者hla-dq β 57位均为ala,提示mg的发生也有其他基因或因子参与。mg是一种多基因控制的疾病，hla－dq只是其中一个遗传座位。对每个病例同时进行dqa1、dqβ1基因型确定及单倍型分析以确定患者的易患dq α β二聚体，以及对mg其他相关基因的分离应是以后研究的方向。
志谢 上海医科大学公共卫生学院流行病教研室边建超博士在统计学方面给予了帮助
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本课题由国家自然科学青年基金资助(no.39500049)
(收稿：1998-01-09 修回：1998-09-15)
