血友病a、b诊断试剂盒的研制
中国输血杂志 2000年第3期第13卷 研究报告
作者：肖小璞 杨显富 林芳昭 周宇 闻欣 赵青蓉 孙小成 王憬惺
单位：中国医学科学院 中国协和医科大学 输血研究所 610081
关键词： 凝血因子ⅷ；凝血因子ⅸ；血友病；检测
中图分类号 r554＋.1 r446
血友病是一组遗传性出血性疾病,其中血友病a和血友病b分别因凝血因子ⅷ(fⅷ)和凝血因子ⅸ(fⅸ)异常而引起。早期的诊断和治疗是防止该类疾病因出血带来不良后果的重要措施。20世纪50年代抗血友病因子a、抗血友病因子b定量分析法［1，2］即己出现，其基本原理是用缺乏fⅷ或fⅸ的血浆作为实验的基质，在脑磷脂存在下，测定样品复钙后凝固所需要的时间，该时间的长短，与样品中fⅷ促凝活性(fⅷ：c)或fⅸ促凝活性(fⅸ：c)的高低有关，由此可计算出样品中fⅷ：c或fⅸ：c水平。后又在实验反应体系中加入表面接触活化剂——高岭土，使方法的敏感性得到较大的提高［3］。目前，用上述原理检测fⅷ：c、fⅸ：c的方法仍然是血友病的主要确诊方法。长期以来，由于没有国产的血友病诊断试剂，使我国在血友病诊断治疗方面尚处于较落后的状态，不少血友病患者得不到及时的诊断和治疗，以致危及生命。为此，笔者根据上述检测原理，分别研制出了两种血友病的诊断试剂盒，现报告如下。
1 材料和方法
1.1 缺fⅷ血浆(fⅷ-dp) 参照参考文献［4］方法，将多人份混合新鲜血浆经乙二胺四乙酸二钠盐处理，使fⅷ：c活性被灭活。将处理后血浆分装、冻干。用前以蒸馏水复溶。
1.2 缺fⅸ血浆(fⅸ-dp) 将多人份混合新鲜血浆通过抗fⅸ单克隆抗体免疫亲和层析柱，fⅸ被吸附，流过液即为fⅸdp［5］。收取流过液，分装、冻干。用前以配套溶解液复溶。
1.3 活化 部分凝血活酶试剂(aptt试剂) 按参考文献［6］方法制备脑磷脂，分装、冻干，用前加高岭土悬液溶解、混合。
1.4 氯化钙(cacl2)溶液。
1.5 稀释液 0.05 mol/l咪唑，0.1mol/l氯化钠， 用1.0mol/l盐酸调ph至7.3。
1.6 正常人参比血浆 由30份以上的健康人混合新鲜血浆(枸橼酸钠抗凝)分装、冻干制成。用前以蒸馏水复溶。
1.7 样品 正常人及血友病a、b患者血浆。
1.8 fⅷ:c、fⅸ:c测定基本方法 取经稀释液适当稀释的正常参比血浆或受检血浆0.1ml、fⅷ-dp(或fⅸ-dp)0.1ml、aptt试剂0.1ml，加入反应管中混匀，立即置37℃温育适当时间，然后加入经37℃预热的cacl2溶液0.1ml，测定凝固时间。
1.9 温育曲线制作(不同温育时间样品凝固时间测定) 对1/10稀释的正常参比血浆，按1.8中基本方法，测定温育时间分别为2、4、6、…、20min的凝固时间，以温育时间为横坐标，凝固时间为纵坐标制图，即得fⅷ:c或fⅸ:c测定实验的温育曲线。
1.10 实验条件的优化 以不同浓度水平脑磷脂、高岭土和cacl2作为设计因素，选用l4(23)正交表设计试验，根据1.9中温育曲线制作方法，分别按正交表的设计制作各编号试验的fⅷ:c和fⅸ:c温育曲线，根据曲线稳定时间长短对各编号试验结果评分并进行正交分析，选取能使稳定时间更长的试剂组合条件和该条件下温育曲线稳定段中部的温育时间，最终形成试剂盒的实验条件。
1.11 试剂盒的组装 根据1.10选取的实验条件，分别将fⅷ:c和fⅸ:c检测所需的各种试剂装配成套，配以使用说明书。两种试剂盒中除缺凝血因子血浆不同，其余试剂均相同，即试剂盒由fⅷ-dp(或fⅸ-dp)、aptt试剂、cacl2溶液，正常人参比血浆和稀释液组成。
1.12 fⅷ:c(或fⅸ:c)测定的标准曲线制作 用自制试剂盒，分别测定1/5、1/10、1/20、…1/640稀释的正常参比血浆的凝固时间。分别视其对应fⅷ:c(fⅸ:c)百分活性为200%、100%、50％、…、1.56％。以正常参比血浆fⅷ:c(或fⅸ:c)百分活性为x(横坐标)，对应的凝固时间为y(纵坐标)，按统计学方法作直线回归方程y=a－blogx，并求出相关系数。
1.13 样品fⅷ:c(或 fⅸ:c)的测定和计算 用自制试剂盒，测定经适当稀释的样品的凝固时间，将样品凝固时间代入标准曲线的直线回归方程，计算出x值，并根据样品稀释倍数，算出样品fⅷ:c(或fⅸ:c)百分活性值。
1.14 复溶试剂的稳定性考察 将全套试剂复溶(正常参比血浆除外)，4℃存放，分别于0、1、2h时，测定同一组样品fⅷ:c和fⅸ:c的凝固时间，并对数据进行统计分析。
2 结果和讨论
2.1 实验条件的优化 以正交试验的结果为主要依据，在允许的范围内，同时兼顾实际操作中的一些因素，如便于试剂的制备、有利结果观察等等，最后确定优化的试剂组合条件为：脑磷脂稀释度1/100～1/150，高岭土悬液浓度8.0g/l，cacl2溶液浓度0.035mol/l。在此条件下，温育曲线稳定时间从温育6min开始，直至14min（表1）。因此，在6～14min中间选择温育的最佳时间，可使实验的稳定性得到保证，笔者选择10min作为试剂盒实验方法的温育时间。
表1 不同温育时间正常血浆凝固时间(温育曲线)
试验
项目
温 育 时 间(min)
2468101214161820
fⅷ：c92.480.877.676.977.677.177.479.481.883.5
fⅸ：c76.363.760.960.360.761.460.963.363.764.4
2.2 标准曲线线性情况 由表2、3可见：血友病a与血友病b诊断试剂盒标准曲线（n=8，测定范围：1.56%～200%）的截距（a）均值分别为91.54s与66.85s；斜率（b）均值分别为－31.64与－18.99；相关系数（r）均值分别为－0.993与－0.996；剩余标准差（sy.x）均值分别为2.87s与1.42s(n=3)，直线相关系数(回归系数)假设检验说明两种试剂盒标准曲线各点凝固时间与百分活性的对数之间呈较好的线性关系。
表2 fⅷ：c试剂盒标准曲线线性（n＝8，p＜0.001）
试剂盒
编号
abrsy.x直线回归方程
192.88－32.63－0.9981.71y＝92．88－32.63logx
290.21－29．65－0．9942．68y＝90.21－29．65logx
391.54－32．64－0．9874．21y＝91.54－32．64logx
91.54－31.64－0．9932．87
表3 fⅸ：c试剂盒标准曲线线性（n＝8，p＜0.001）
试剂盒
编号
abrsy.x直线回归方程
166.26－18.23－0.9961.38y＝66．26－18.23logx
267.27－18．88－0．9971．24y＝67.26－18．88logx
367.02－19．87－0．9951．65y＝67.02－19．87logx
66.85－18.99－0．9961．42
2.3 测定不同稀释度正常参比血浆凝固时间的重现性 表4、5显示：血友病a与血友病b诊断试剂盒凝固时间测定的变异系数(cv)值分别为1.32％～3.89％与0.58％～1.85％,平均为2.31％与1.38％(n=8)，其重现性良好。
表4 血友病a试剂盒凝固时间(s)测定的重现性
试剂盒
编号
fⅷ：c水平(%)
200100502512.56.253.131.56
182.291.4103.4113.0124.5134.2141.0149.8
280.188.6100.1108.3118.6128.4137.2138.9
380.889.3100.7112.3122.1138.8140.1144.7
81.0389.77101.40111.20121.73133.80139.43144.46
s1.071.461.762.542.975.211.995.45
cv(%)1.321.631.742.282.443.381.433.77
表5 血友病b试剂盒凝固时间(s)测定的重现性
试剂盒
编 号
fⅸ：c水平(%)
200100502512.56.253.131.56
160.465.471.378.084.089.494.397.0
261.166.273.179.185.991.195.999.4
360.864.973.480.186.692.597.0100.6
60.7765.5072.6079.0785.591.0095.7399.00
s0.350.661.141.051.351.551.361.83
cv(%)0.581.011.571.331.581.701.421.85
2.4 测定样品活性水平及重现性 表6、7数据表明：两种试剂盒均能反映出正常人以及不同病情血友病样品的相应凝血因子百分活性水平，并能测定出活性低至1％的样品；样品重复测定变异系数均值血友病a诊断试剂盒为5.53％、血友病b诊断试剂盒为5.42％(n=3)。
表6 测定样品fⅷ：c活性水平(%)及重现性
样品测定次数scv
(%)
12345
正常人75.083.973.380.872.377.065.056.55
亚临床血友病a26.926.328.427.928.227.540.903.27
重型血友病a1.11.21.31.21.11.180.086.78
5.53
表7 测定样品fⅸ：c活性水平(%)及重现性
样品测定次数scv
(%)
12345
正常人100.199.4100.3102.093.999.143.083.11
轻型血友病b15.316.316.914.215.515.641.036.58
重型血友病b1.31.21.21.11.31.220.086.56
5.42
2.5 试剂复溶后4℃存放稳定性 由表8、9数据表明,复溶试剂4℃存放0、1、2h后，所测凝固时间变异系数均值血友病 a试剂盒为1.55％，血友病b为2.34％(n=8)，说明复溶试剂在4℃存放2h，对测定结果影响不大。
表8 复溶fⅷ：c试剂4℃存放后测样品情况
样品号不同存放时间(h)测样品凝固时间(s)scv
(%)
012
165.468.069.267.531.942.87
276.377.079.177.471.461.88
385.987.188.787.201.451.66
495.896.098.696.881.561.55
5103.6105.8107.9105.772.152.03
6110.3112.2115.5112.672.632.33
7117.2118.7119.6118.501.211.02
8119.7121.4122.3121.131.321.09
1.55
表9 复溶fⅸ：c试剂4℃存放后测样品情况
样品号不同存放时间(h)测样品凝固时间(s)scv
(%)
012
161.163.365.363.232.103.32
265.167.568.567.031.752.61
370.873.176.373.402.763.76
476.478.781.378.802.453.11
582.885.486.885.002.032.39
688.790.389.989.630.830.93
790.093.893.192.631.461.58
892.794.194.593.770.951.01
2.34
2.6 两种试剂盒中aptt试剂采用高岭土配制，适用于手工法(肉眼观察法)和磁珠法(粘度法)原理的仪器，对于光学法原理的仪器，由于受高岭土沉降影响，可选用微粒硅或鞣花酸配制aptt试剂。进一步的研究，笔者将作另行报道。
由于两种试剂盒可分别定量检测fⅷ:c和fⅸ:c水平，故不仅能用于血友病a、b的诊断、病情轻重的分型和疗效观察，并能用于fⅷ和fⅸ相关疾病的诊断或疗效观察，如血管性血友病、肝脏疾病等等，亦能用于治疗用fⅷ、fⅸ制品生产的质量监控以及止血与血栓的基础研究之中。试剂盒的保存效期(未复溶的)及不同批生产的试剂盒质量考察的相关工作正在进行之中。
参考文献
1，langdell rd,wagner rh,brinkhous km,et al. effect of antihemophilic factor on one-stage clotting tests. j lab clin med，1953,41:637
2，stapp wf. a one stage method for the assay of antihemophilic factor b. scand j clin lab invest，1958,10:169
3，proctor rr, rapaport sl. the partial thromboplastin time with kaolin. am j clin pathol，1961,36:212
4，chantarangkul v,ingrant,gic,thron mb,et al. an artificial haemophilic plasma for one-stage. br j haematol,1978,40:471
5，王海龄,肖小璞，丁 卫，等.单克隆抗体免疫亲和层析法制备缺凝血因子ⅸ人基质血浆的初步报告.中国输血杂志，1990,3(1):1
6，bell w, alton hg. a brain extract as a substitute for platelet suspension in thromboplastin generation test. nature，1954, 174:880
1999-12-31收稿
2000-06-28修回
